Principales associations opposées au projet
SEPANSO
Fédération des Sociétés pour l'Étude, la Protection et l'Aménagement de la Nature dans le Sud-Ouest, association créée en 1969, membre de France Nature Environnement.
Alternative Régionale Langon Pau
Fédération des associations locales opposées au projet d'autoroute A65, créée en 2005 à Bostens (40), par des associations locales de Pujo le plan (40), Coimères (33), Doumy (64), Bostens (40), ...

Les Planteurs volontaires
Autres acteurs
Des associations nationales de défense de l'environnement (Réseau Action Climat, Greenpeace, France Nature Environnement, la FNAUT, les Amis de la Terre, la Fondation Nicolas Hulot) ont manifesté à plusieurs occasions leur opposition au projet.
Des syndicats locaux (CGT et CFDT) se sont également associés à l'opposition.
Politiquement, les Verts et le Parti communiste se sont également opposés au projet.
Un appel aquitain à réévaluer le projet publié en 2008 donne une liste indicative de ces acteurs.